作为分割细胞与外界环境的屏障，细胞膜参与物质运输、信号转导、细胞识别等生理活动。实时观测细胞膜形态及其动态变化对细胞生物学及发育生物学等领域具有重要意义。荧光成像作为一种实时非入侵式的观测手段，已经成为了研究细胞膜的重要工具。近年来，荧光成像逐渐从宽场和共聚焦向超分辨和长时程成像转变，希望以前所未有的时间和空间分辨率检测细胞膜形态及动态变化。然而，这对细胞膜染料的光物理和光化学性质提出了更高的要求。在超分辨和长时程成像中，过强的激发光和过长的曝光时间会导致明显的光毒性“灼伤”细胞和光漂白“吞噬”信号。因此，传统的细胞膜染料难以长时间对细胞膜的生理状态进行观测，无法满足细胞膜成像对超高时空分辨率的新要求。

2025年07年15日，北京大学未来技术学院、北大-清华生命科学联合中心、膜生物学全国重点实验室陈知行课题组在Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.杂志上发表研究成果，报道了一系列温和细胞膜探针，具有优异的光稳定性和显著降低的光毒性，在不诱导内吞的无血清成像液中可以实现对癌细胞系和多种原代细胞的STED及SIM超分辨成像以及对神经、生殖等细胞运动及发育过程的长时程追踪。

北大陈知行课题组2018年建立以来一直致力于低光毒性染料的开发，先后报道了低光毒性线粒体染料PK Mito（Chem Sci 2020，PNAS 2022 cover story）、膜电位探针HVI-COT（PNAS 2023）和罗丹明GR（ACS Central Sci 2024），致力于为荧光成像新时代提供新一代低光毒性、高光稳定性的染料。该研究在上述研究的基础上，基于三线态淬灭剂偶联策略，将三线态淬灭剂COT、荧光母核花青与两亲性膜定位基团整合为新一代低光毒性细胞膜染料PK Mem。与商用细胞膜染料MemGlow相比，同波段的PK Mem单线态氧量子产率降低了56-77%，光稳定性提高了1.3-3.1倍，更适用于长时程成像。该系列染料不仅可以标记HeLa、KB等细胞系，也可以对小鼠胚胎干细胞、大鼠海马神经元、精子和成熟心肌细胞等原代细胞的精细细胞膜结构（图1）以及小鼠脑片和活体神经元染色。

图1. PK Mem dyes共聚焦成像癌细胞系和原代细胞

长时程活细胞成像常面临光毒性引发的细胞膜起泡及细胞死亡等难题，极大地限制了对细胞膜形态以及迁移、收缩、发育等动态过程的深入观察。PK Mem由于具有显著降低的光毒性和增强的光稳定性，成功实现了多种细胞类型中细胞膜的长时程活细胞成像。研究团队以HeLa细胞为模型，对比PK Mem 555与MemGlow 560标记下的细胞膜成像，PK Mem 555显著延缓细胞起泡时间，表现出更低的光毒性，其他波长的PK Mem dyes亦具有类似优势。高通量成像和细胞存活率检测进一步证实PK Mem染料有效减少长时程成像引起的光损伤。在细胞迁移实验中，PK Mem 555标记的L929细胞保持高速稳定迁移并形成迁移体，而MemGlow 560标记的细胞迁移能力迅速衰减甚至死亡。对于更敏感的原代神经元和心肌细胞，PK Mem同样具备优异的生物相容性，支持在高频率成像下监测新生大鼠心肌细胞持续跳动和海马神经元长达20.5 h的轴突生长成像。此外，PK Mem 555成功记录了C. elegans 体外精子发生过程，低光毒性确保81%以上细胞正常发育，远超MemGlow 560约12%的成功率，凸显其在复杂细胞动态成像中的独特优势（图2）。美中不足的是PK Mem和现有其他膜染料在含有血清的培养基中仍然存在内吞问题，一定程度上会影响细胞膜观测。

图2. 利用PK Mem 555长时程成像细胞多种生命活动

在神经元领域，细胞膜的精细动态过程如生长锥的扩展与收缩、轴突的导向和分支，对于神经发育、回路重塑及神经再生至关重要。传统的膜染料在长时间、高频率成像中常因光毒性导致神经元损伤，严重限制了对这些动态过程的深入观察和研究。PK Mem 555在轴突生长锥成像中展现出碾压性优势。相比传统染料MemGlow 560（引发88±11%生长锥坍塌），PK Mem 555在20分钟高时空分辨率成像（2秒/帧）下实现零光毒性损伤，还可以精准捕捉丝状伪足动态（0.25秒/帧）。此外，PK Mem还可与标记骨架成分的SPY650-FastAct（肌动蛋白）和SPY555-Tubulin（微管）共用，实现膜与细胞骨架的同步可视化（图3）。值得一提的是，PK Mem在神经元中的有效标记浓度极低，仅需50 nM或更少，即可获得清晰均匀的细胞膜标染色，因此PK Mem很适用于对生理状态要求极高的神经元系统。

图3. 低光毒性PK Mem dyes高时空分辨率成像神经元生长锥

此外，显著提高的光稳定性使PK Mem成为了一款性质优异的超分辨成像染料。PK Mem 590的光谱与775 nm的STED光完美匹配。在STED显微镜下，可以在小于100 nm的分辨率下清晰地观测到心肌成纤维细胞的迁移体以及小鼠海马神经元的轴突和树突棘等微小结构，并实现神经元生长锥超过10张的STED延时成像。通过与低光毒性线粒体染料PK Mito Deep Red共染，可以通过SIM超分辨长时（>7 h）成像观测神经元轴突内的线粒体运输过程（图4）。

图4. PK Mem dyes适配超分辨成像

综上，研究团队基于三线态淬灭剂偶联策略开发了新一代细胞膜染料PK Mem，具有显著降低的光毒性和提高的光稳定性，适用于STED及SIM超分辨长时程观测细胞膜的精细结构与多种质膜生理活动，可以与其他染料或抗体联用，对细胞膜形态及动态变化进行超高时空分辨率成像。尤其是在神经元成像中展示出卓越性能，仅需20 nM就可以清晰标记树突棘形态，并支持生长锥延伸与线粒体运输的超分辨动态追踪。PK Mem系列有望成为超分辨时代细胞膜成像领域新标准试剂。

北京大学前沿交叉学科研究院、北大-清华生命科学联合中心已毕业博士凌靖（现为美国加州大学圣地亚哥分校博士后）、北京大学生命科学联合中心博士生刘奕彤、苏黎世大学分子生命科学系博士后Alexandre Dumoulin为共同第一作者。北京大学未来技术学院、北大-清华生命科学联合中心、膜生物学重点实验室陈知行副教授为该文的通讯作者。北京大学席鹏教授、西湖大学生命科学学院唐鸿云研究员和苏黎世大学分子生命科学系Esther T. Stoeckli教授共同参与了该项研究工作。西湖大学博士生盛丹莉、北京大学未来技术学院博士生付允哲、北京大学化学与分子工程学院博士后刘书彰、北京大学第三医院已毕业博士丁灵和北京大学生命科学学院已毕业博士黄露露对文章做出了重要贡献。该工作得到了国家自然科学基金委、科技部国家重点研发计划、北京分子科学国家研究中心和瑞士国家科学基金会的经费资助，以及北京大学分析测试中心、国家蛋白质科学基础设施（北京）北大分中心、北京大学南京分子医学转化院脑观象台、北京艾锐精仪科技有限公司和南京浦海景珊生物技术有限公司的技术支持。

目前该探针由南京浦海景珊生物技术有限公司销售，并与瑞士Spirochrome公司合作进行全球推广。作为自主知识产权前沿生物技术，该成果有望推动细胞膜动态相关研究方向与超高时空分辨成像融合，最终惠及广大细胞膜领域研究工作者。

A gentle palette of plasma membrane dyes

Jing Ling, Yitong Liu, Alexandre Dumoulin, Danli Sheng, Yunzhe Fu, Shuzhang Liu, Ling Ding, Lulu Huang, Peng Xi, Hongyun Tang, Esther T. Stoeckli, and Zhixing Chen

PNAS, 2025, 122, e2504879122, DOI: 10.1073/pnas.2504879122

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